Kính hiển vi điện tử nhiệt độ thấp: Từ quan sát protein đến Nobel Hóa học

Ủy ban Giải thưởng Nobel hóa học giải thích, thành tựu giúp "mở ra một thế giới hoàn toàn mới khi giờ đây chúng ta đã có thể quan sát các phân tử và cách thức chúng tương tác dễ dàng hơn”,

Từ thách thức cấu trúc protein

Ngày nay, bạn có thể dễ dàng tìm thấy các hình ảnh các virus siêu nhỏ (thậm chí ảnh 3D có chất lượng cao) do các nhà khoa học chụp bằng các công cụ hiển vi điện tử tối tân, điều cách đây hơn 30 năm từng gây đau đầu cho các nhà vật lý, sinh học bởi quá khó để nhìn thấy chúng bằng các công cụ quan sát thời đó. Từ những năm 1950, cấu trúc tinh thể đầu tiên của một số protein được xây dựng ở Đại học Cambridge (Vương quốc Anh) nhờ các phép nhiễu xạ tinh thể tia X. Từ đó, các nhà khoa học bắt đầu giả lập hình ảnh các phân tử protein. Nhưng để làm được điều đó, họ phải tinh thể hóa protein, vốn không dễ đạt được vì nhiều protein nằm ở bên trong màng tế bào.

Ban đầu, Richard Henderson2 theo đuổi nghiên cứu cấu trúc protein bằng tinh thể học tia X kể từ khi còn là nghiên cứu sinh ở Cambridge. Ông mong muốn chụp hình ảnh protein bằng tia X nhưng không thể đạt được vì vấn đề tinh thể hóa các protein. Khi thấy các đồng nghiệp nghiên cứu về cấu trúc vật liệu quan sát cấu trúc vật rắn với khả năng quan sát ở cấp độ nguyên tử bằng kính hiển vi điện tử truyền qua, Henderson tin rằng đây chính là công cụ mà ông đang cần. Tuy nhiên thực tế không hề đơn giản như vậy đối với các vật liệu sinh học mà Henderson đang nghiên cứu.

Kính hiển vi điện tử tối tân

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope – TEM) là công cụ quan sát tối tân của các nhà vật lý học dùng để quan sát cấu trúc vật rắn do Ernst Ruska và Max Knoll phát minh vào năm 1931 ở Berlin. Hiểu một cách đơn giản thì sử dụng TEM tương tự như việc phóng đại ảnh ở các kính hiển vi ánh sáng được dùng bởi các nhà sinh học để nhìn các tế bào bé xíu. Do sóng ánh sáng có bước sóng rất dài (cỡ 400 nm là ánh sáng ngắn nhất) nên TEM không thể tạo được ảnh của các vật thể nhỏ hơn như vậy. Vì thế, thay vì dùng sóng ánh sáng, Ruska và Knoll đã dùng sóng điện tử được gia tốc dưới điện trường cao (hàng trăm kilovolt) có bước sóng cực ngắn (ví dụ như chùm điện tử 100 kV sẽ có bước sóng nhỏ hơn 0,004 nm) để chiếu qua mẫu vật, và dùng các thấu kính điện từ để tạo ảnh thay vì các thấu kính thủy tinh. Nhờ đó, TEM có thể tạo độ phóng đại hàng triệu lần và có thể phân giải các vật thể nhỏ tới cấp độ nguyên tử3. Bên cạnh khả năng quan sát các vật thể siêu nhỏ, TEM có thể tính toán cấu trúc tinh thể nhờ ghi lại phổ nhiễu xạ khi điện tử nhiễu xạ trên mẫu vật, hay xác định thành phần và liên kết hóa học nhờ tương tác của chùm điện tử với nguyên tử; hay xác định cấu trúc điện từ của vật rắn… Vì thế, TEM là một công cụ quan sát và phân tích tối tân của các nhà vật lý cho các nghiên cứu vật liệu rắn, và được yêu thích trên toàn thế giới cho đến tận ngày nay.4

Hình 1. (a,b) Ảnh chụp một thiết bị TEM và nguyên lý quang học điện tử ở TEM 6,  (c) mô hình 3D của protein đầu tiên công bố bởi Henderson (1975) dựng từ các bức ảnh TEM có độ phân giải 7 Å 7.

Lý do gì khiến cho TEM không thể sử dụng cho các mẫu sinh học? Thứ nhất, tất cả cơ cấu quang học của TEM được đặt trong một cột chân không siêu cao (nhằm làm giảm việc mất mát năng lượng của sóng điện tử) nên nó làm khô các tế bào sinh học và trở nên không tương thích với các mẫu tế bào hay protein; thứ hai, sóng điện tử có năng lượng rất cao và thường làm cháy các mẫu tế bào. Thế nhưng Henderson vẫn tin rằng TEM là một công cụ tuyệt vời cho các nghiên cứu của ông.

TEM và các phân tử sinh học – các kết quả đầu tiên

Henderson đã đạt được thành tựu đầu tiên vào năm 1975 với mô hình protein đầu tiên được dựng từ những bức ảnh chụp TEM trên mẫu bacteriorhodopsin. Lúc đó do kỹ thuật làm lạnh chưa phát triển nên Henderson đã dùng dung dịch glucose để bảo vệ mẫu trong chân không, giảm liều lượng chùm điện tử chiếu qua mẫu ở mức rất thấp (chỉ có khoảng 1 điện tử đi qua diện tích 0,01 nm2 trong một giây) và đạt độ phân giải bất ngờ 7 Angstrom. Bằng việc chụp hình chiếu của phân tử protein ở nhiều góc chụp khác nhau (quay nghiêng mẫu) và kết hợp với ghi nhận phổ nhiễu xạ điện tử, Henderson đã xây dựng thành công mô hình ba chiều đơn giản đầu tiên của phân tử protein và khẳng định chắc chắn rằng TEM là công cụ tuyệt vời mà các nhà sinh học cần dùng để quan sát các phân tử sinh học.

Đông cứng tế bào và cryo-EM

Tuy chứng minh được tính hữu dụng của TEM nhưng Henderson vẫn gặp phải vấn đề bảo vệ mẫu trong buồng TEM. Việc giảm liều lượng chùm điện tử khiến ảnh trở nên rất kém chất lượng, thế nên để có ảnh chất lượng, việc tìm ra cách bảo vệ mẫu ở chùm điện tử mạnh trở nên quan trọng hơn bao giờ hết. Đông cứng mẫu trong môi trường nước vẫn là biện pháp phổ biến được dùng sau đó, nhưng nó lại tạo ra sự khó chịu khác: nước khi đông lạnh lại sẽ trở thành các tinh thể đá và bức ảnh TEM chụp được sẽ là các protein nằm trên một nền tinh thể nước.Tinh thể nước sẽ tán xạ các điện tử rất mạnh mẽ và khiến cho tương phản của protein trong ảnh TEM trở nên mờ nhạt.

Hình 2. (a) Nguyên lý xử lý mẫu sinh học của Dubochet bằng cách đông cứng nhanh nước trong ethane lạnh, (b) ảnh chụp một cryo-TEM (FEI Tecnai Polara) ở Đại học Manchester (Anh), (c) ảnh TEM chụp các phân tử protein với độ tương phản mạnh của Dubochet, (d) mô hình ba chiều protein bacteriorhodopsin công bố bởi Henderson năm 1990

Năm 1978, khi trở thành trưởng nhóm nghiên cứu ở Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử châu Âu ở Heidelberg (Đức), Jacques Dubochet7 bắt đầu theo đuổi nghiên cứu tương tự Henderson từ cách tiếp cận bảo vệ mẫu. Năm 1982, nhóm của Dubochet đã tìm ra cách giải quyết vấn đề tinh thể nước khi tạo ra mẫu chứa nước đông cứng bằng cách làm đông cứng nhanh trong ethane được làm lạnh ở nhiệt độ -196oC bằng nitơ lỏng. Cách làm đông cứng nhanh này cho phép giữ nguyên trạng thái không có cấu trúc tinh thể của nước, nhờ vậy nhóm của Dubochet đã chụp được những bức ảnh TEM chất lượng cao của các virus trong nước, với nhiều hình dạng khác nhau ở mức độ tương phản cực tốt. Từ đây, kỹ thuật cryoTEM (hay cryoEM) bắt đầu được phát triển từ đột phá của Dubochet. Người ta đã phát triển các công cụ làm lạnh mẫu và duy trì nhiệt độ siêu thấp cho mẫu bằng các công cụ làm lạnh với khí hóa lỏng cho thiết bị TEM, thiết bị mà trước đó không hề được làm lạnh mẫu. Sự phát triển của cryo-TEM giúp cho Henderson một lần nữa thành công rực rỡ khi công bố các bức ảnh chụp 3D của mẫu protein bacteriorhodopsin với độ phân giải siêu cao - cấp độ nguyên tử vào năm 1990. Lần này, kỹ thuật tạo ảnh TEM 3 chiều của các phân tử protein đã trở nên đơn giản hơn rất nhiều nhờ một đóng góp khác về mặt tính toán của Joachim Frank làm việc ở phía bên kia Đại Tây Dương.

Kỹ thuật tạo ảnh 3D của Frank

Sau những công trình đầu tiên về ảnh 3 chiều của Henderson, năm 1975 Joachim Frank8 đã đưa ra một chiến lược lý thuyết nhằm xây dựng các bức ảnh 3 chiều từ các bức ảnh chụp 2 chiều của các phân tử protein. Khi các phân tử protein (có các định hướng ngẫu nhiên) tạo ra các vết tích trên bức ảnh TEM (vốn là ảnh 2 chiều), máy tính sẽ phân biệt các vết tích này với nhiễu nền và đặt các vết tích tương đồng nhau vào một nhóm. Bằng cách lọc ra hàng ngàn các vết tích, máy tính sẽ tạo ra một bức ảnh TEM 2 chiều có độ phân giải cao. Bằng cách tạo ra các bức ảnh 2D có độ phân giải cao từ cùng protein được chụp từ nhiều góc độ khác nhau, phần mềm sẽ dựng nên một bức ảnh 3 chiều có độ phân giải cao của các phân tử protein. Frank đã mất gần 10 năm để hoàn thành công trình này và ra mắt phần mềm máy tính vào giữa những năm 80, và lần đầu tiên ứng dụng thành công để xây dựng nên mô hình của ribosome. Thuật toán của Frank trở thành nền tảng cho các camera ghi ảnh và xử lý ảnh 3 chiều trong các cryo-TEM.

Chặng đường từ những bức ảnh TEM đầu tiên về các phân tử protein cho tới sự phổ biến của các cryo-TEM dùng cho nghiên cứu các mẫu sinh học ở cấp độ hạ tế bào trong gần 40 năm giúp mở ra những chân trời mới ở cấp độ hạ tế bào và giờ đây, mọi góc tối của tế bào đều có thể được khám phá nhờ cryo-TEM.9 Việc Henderson, Dubochet và Frank được trao giải Nobel nhiều người bất ngờ, nhưng sự bất ngờ không phải ở việc nghi ngờ họ có xứng đáng hay không, mà bất ngờ vì những đóng góp của họ được nhân loại ghi nhận và vinh danh sớm hơn nhiều người tưởng.
--------------------
1. Bài viết sử dụng nhiều tư liệu từ bài giới thiệu của Ủy ban Nobel về Giải Nobel Hóa học 2017.
2. Richard Henderson (sinh năm 1945 ở Edinburgh, Scotland), tốt nghiệp Đại học Edinburgh và nhận bằng PhD tại Cambridge năm 1969.
3. Các TEM hiện đại ngày nay có thể đạt độ phân giải tới 0,5 Å tức là ở mức độ hạ nguyên tử.
4. Dù đã phổ biến trên thế giới hơn 50 năm qua, TEM vẫn là một công cụ tối tân, đáng mơ ước ở bất kỳ phòng thí nghiệm phân tích vật liệu nào. Ở Việt Nam, thiết bị TEM đã và đang được vận hành ở một số phòng thí nghiệm (ví dụ như Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Vệ sinh Dịch tễ, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ,..). TEM là một thiết bị tối tân, vận hành khá phức tạp, đòi hỏi chi phí vận hành lớn và nhân lực vận hành được đào tạo bài bản.
5. Hình trích từ Ngô Đức Thế, Các kỹ thuật Hiển vi Điện tử và Vi phân tích, NXB ĐHQGHN (2017).
6. R. Henderson & P. N. T. Unwin, Nature 257, 28-32 (1975).
7. Jacques Dubochet (sinh năm 1942) là công dân Thụy Sĩ, nhận bằng PhD về lý sinh năm 1973 ở Đại học Geneva và Basel.
8. Joachim Frank (sinh năm 1940 ở Đức), học đại học ở Đức, nhận bằng PhD ở Đại học Kỹ thuật Munich trước khi sang Mỹ làm việc và định cư.
9. Đánh giá của Ủy ban Nobel.