Công nghệ phát hiện đột biến gene đạt độ nhạy 0,01%

Tập thể khoa Sinh học phân tử, bệnh viện TƯQĐ
108

Các phương pháp phát hiện đột biến hiện hành

Với các nhà sinh học phân tử, việc phát hiện đột biến sinh ung thư không phải là vấn đề dễ dàng bởi hai nguyên nhân chính. Thứ nhất, những đột biến gene thường không diễn ra ở tế bào khỏe mạnh mà chỉ xảy ra ở tế bào ác tính (ví dụ như các trường hợp đột biến gene EGFR, Kras, PIK3CA trong ung thư phổi, đại trực tràng hoặc FLT3, NPM1, Jak2… trong ung thư máu). Thứ hai, các phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm có độ chính xác thấp do không thể đảm bảo toàn bộ bệnh phẩm đều là các tế bào ác tính cũng như mọi tế bào ác tính đều mang đột biến.

Vì thế phương pháp phát hiện đột biến phải có độ nhạy kỹ thuật cao để phát hiện được các đột biến ngay cả khi nó xuất hiện ở mức thấp trong mẫu bệnh phẩm, thậm chí lưu hành trong máu ngoại vi.

Cho đến nay, các hiệp hội quốc tế như Hội Ung thư lâm sàng châu Âu (European society for Medical Oncology), Hội Ung thư Mỹ (American Society of Clinical Oncology) và bản thân các cơ quan bảo hiểm cũng như Bộ Y tế Việt Nam chưa hề quy định một phương pháp chuẩn trong phát hiện các đột biến bệnh sinh ung thư.

Chính vì thế nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đưa ra một số phương pháp phát hiện đột biến cũng như các quy trình thu gom bệnh phẩm khác nhau. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm khác biệt.

Phương pháp Giải trình tự gene trực tiếp (Sanger sequencing) là phương pháp rẻ tiền nhất, dễ triển khai nhất nhưng độ nhạy kỹ thuật thấp nhất (nó chỉ có thể phát hiện đột biến khi lượng tế bào mang đột biến phải lớn hơn 20% tổng số tế bào. Thông thường để đảm bảo có đủ lượng tế bào ác tính, các phòng thí nghiệm triển khai giải trình tự gene (đa số ở nước ta triển khai phương pháp này) phải yêu cầu sự trợ giúp từ các nhà giải phẫu bệnh khoanh vùng khu vực bệnh phẩm có tế bào ác tính trước khi tiến hành tách DNA để phát hiện đột biến. Do thiết bị đắt tiền và hóa chất phải nhập ngoại nên giá thành xét nghiệm phát hiện đột biến EGFR bằng phương pháp này không hề rẻ (cỡ khoảng 5 triệu/bệnh nhân/lần xét nghiệm). Kỹ thuật này hiện nay đã được triển khai tại hầu hết các phòng xét nghiệm sinh học phân tử ở Việt Nam, bao gồm cả Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện 108.

Phương pháp realtime PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực - Polymerase Chain Reaction) dựa trên đầu dò phân tử taqman probe. Trong trường hợp đầu, taqman được thiết kế tích hợp công nghệ ARMS (hệ thống đột biến chịu nhiệt khuếch đại - Amplification Refractory Mutation System) thì độ nhạy kỹ thuật khá cao, có thể phát hiện được đột biến khi tế bào ác tính mang đột biến ở mức trên 1%. Vì thế phương pháp này không chỉ ít phụ thuộc vào các nhà giải phẫu bệnh mà còn có thể khoanh vùng các khu vực có tế bào ác tính và thậm chí có thể áp dụng phát hiện đột biến EGFR từ DNA lưu hành tự do trong máu ngoại vi, thay vì phải sinh thiết khối u, làm mô bệnh học.

Do không tự thiết kế được các đầu dò phân tử đặc hiệu theo công nghệ ARMS nên tất cả các phòng thí nghiệm có sử dụng phương pháp này ở nước ta đều phải nhập khẩu kit chẩn đoán tương ứng. Giá thành xét nghiệm phát hiện đột biến EGFR hay Kras, PIK3CA do các cơ sở này cung cấp sẽ rất cao, cỡ khoảng 8 triệu/bệnh nhân/lần xét nghiệm.

Phương pháp dựa trên PCR điện di nhưng tích hợp công nghệ bắt mồi đặc hiệu song hướng (bidirectional allele specific PCR) kết hợp công nghệ ARMS cũng có độ nhạy kỹ thuật rất cao, có thể phát hiện được đột biến khi tế bào ác tính mang đột biến ở mức trên 1%. Nếu sử dụng kit nhập ngoại, giá thành xét nghiệm phát hiện đột biến EGFR làm theo phương pháp này cũng không hề rẻ, khoảng 8 triệu/bệnh nhân/lần xét nghiệm. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là độ nhạy cao, đảm bảo khả năng phát hiện mầm bệnh lớn nhưng giá thành cao nên khó mở rộng ứng dụng trên số lượng lớn người dân Việt Nam [có nhu cầu sử dụng], đặc biệt với những người phụ thuộc vào khả năng thanh toán từ dịch vụ bảo hiểm y tế.

Trước thực tế này, Khoa Sinh học phân tử đã tiến hành thiết kế các thành phần cơ bản của xét nghiệm, bộ sinh phẩm (bộ kit) và quy trình chẩn đoán sử dụng bộ sinh phẩm. Kết quả là khi đưa vào sử dụng bộ kit này tại Bệnh viện 108, mỗi bệnh nhân chỉ phải trả 2,5 triệu/lần xét nghiệm, nghĩa là chỉ gần 1/3 giá thành bộ kit nhập ngoại. Với những người làm nghiên cứu, điều đó hết sức đáng giá bởi ngoài yếu tố chuyên môn, một phương pháp xét nghiệm/cứu chữa bệnh mới còn cần được định lượng bằng những hiệu quả về mặt xã hội và khả năng ứng dụng vào thực tế. Hiện nay xét nghiệm này đã được triển khai áp dụng tại Khoa Sinh học phân tử. Đối với một số cơ sở y tế trong nước mở dịch vụ phân tích đột biến gene, trong đó có đột biến EGFR, chưa có cơ sở nào ngoài Bệnh viện 108 công bố tự thiết kế được xét nghiệm cũng như nêu rõ độ nhạy kỹ thuật của xét nghiệm.

Nâng cao độ nhạy tới 0,01%

Trong quá trình nghiên cứu, Khoa Sinh học phân tử đã tiếp tục nghiên cứu để làm chủ phương pháp phát hiện đột biến gene hiệu quả hơn, phương pháp realtime PCR có sử dụng các kẹp phân tử dạng peptide nucleic acid (peptide nucleic acid clamp). Đây là phương pháp có độ nhạy kỹ thuật cao nhất so với các phương pháp trên, cho phép phát hiện đột biến EGFR khi tỷ lệ tế bào mang đột biến ở mức 0,01%, tức là gấp 100 lần phương pháp Scopion taqman probe và 2.000 lần phương pháp giải trình tự gene trực tiếp. Hơn nữa việc thực hiện xét nghiệm đột biến bằng phản ứng realtime PCR kẹp phân tử này thân thiện hơn rất nhiều cho kỹ thuật viên bởi nó tốn ít sức hơn, có kết quả ngay sau khi chạy máy mà không mất nhiều thời gian phân tích, đồng thời không phải tiếp xúc với nhiều hóa chất độc hại.

Ngoài Bệnh viện 108, một số bệnh viện khác của Việt Nam cũng bắt đầu triển khai xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện đột biến gene Kras, EGFR, EML-ALK, BCR-ABL, PML-RARA, JAK2V617F nhưng chưa cơ sở y tế nào chính thức công bố tự thiết kế được các sinh phẩm (kit) tương ứng mà hầu hết phải nhập khẩu từ nước ngoài. Việc phụ thuộc vào nguồn sinh phẩm và hóa chất từ nước ngoài không chỉ làm đội giá thành xét nghiệm lên mà còn khiến các cơ sở y tế, phòng thí nghiệm trong nước không thể chủ động trong triển khai kế hoạch hoạt động. Khi kinh phí đầu tư cho các phòng thí nghiệm còn hạn hẹp thì việc phải mua nguyên liệu, sinh phẩm nhập ngoại gây lãng phí tiền của. Nó dẫn đến hậu quả là người dân chỉ trọng đồ ngoại, ít tin tưởng vào những sản phẩm do Việt Nam sản xuất.

Chính vì lẽ đó, Khoa Sinh học phân tử đã tự thiết kế và triển khai kỹ thuật realtime PCR kẹp peptide trong chẩn đoán đột biến gene Kras, EGFR. Để đảm bảo độ chính xác và an toàn về công nghệ mới, trước tiên Khoa Sinh học phân tử phải thực hiện quá trình nội kiểm, tự thẩm tra kết quả nghiên cứu giữa nội bộ các phòng thí nghiệm. Dù kết quả đạt được rất khả quan nhưng các nhà nghiên cứu vẫn mong muốn tiếp tục kiểm chứng thành quả nghiên cứu của mình qua hệ thống đánh giá của các tổ chức quốc tế có uy tín. Vào đầu năm 2014, Khoa đã gửi hồ sơ tới Mạng lưới Chất lượng Phân tử châu Âu (European Molecular Quality Network – EMQN), tổ chức chuyên về tiêu chuẩn hóa các dịch vụ trong di truyền gene của con người, cung cấp chứng nhận (ISO 17043) về đánh giá chất lượng ngoài (extermal quality assessment - EQA) cho các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới trong mối liên kết với nhiều tổ chức như EuroGentest, CF Network, UKNEQAS, RCPA QAP, RFB và EAA. Khi nhận được hồ sơ đăng ký của Khoa Sinh học phân tử, EMQN đã gửi mẫu mô và yêu cầu Khoa thực hiện lại quy trình thực hiện kỹ thuật realtime PCR kẹp peptide trong chẩn đoán đột biến gene. Sau ba tháng trao đổi thông tin và thẩm định kết quả, cuối cùng giấy chứng nhận quy trình và bộ sinh phẩm chẩn đoán đột biến đủ tiêu chuẩn an toàn và độ chính xác đã được EMQN cấp.

Trải qua những quá trình “thử lửa” như vậy, công trình nghiên cứu của Khoa Sinh học phân tử đã đủ điều kiện để ứng dụng vào quy trình chẩn đoán bệnh ung thư, qua đó đem lại cơ hội xét nghiệm giá rẻ nhưng có chất lượng tương đương hàng ngoại nhập cho người Việt Nam. Hiện tại Khoa đang hoàn tất thủ tục hồ sơ gửi tới Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ KH&CN nhằm bảo hộ các quy trình chẩn đoán và bộ sinh phẩm chẩn đoán đột biến nói trên.

Dù việc nghiên cứu thành công quy trình và bộ sinh phẩm chẩn đoán đột biến gene mới là thành công bước đầu nhưng với các nhà nghiên cứu ở Khoa Sinh học phân tử, nó mang ý nghĩa đặc biệt khi không chỉ thể hiện sự tự chủ trong công tác nghiên cứu mà quan trọng hơn, còn đem lại sự tự tin về năng lực nghiên cứu khoa học của chính mình.

Ngô Tất Trung - Lê Hữu Song *

Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯ Quân đội 108