Hai enzyme CRISPR giúp chẩn đoán COVID chỉ mất 20 phút

Trong khi đó, xét nghiệm tiêu chuẩn vàng COVID-19 sử dụng qRT-PCR – phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược định lượng – vô cùng nhạy, dò được một sao chép RNA trên mỗi micro lít, đòi hỏi thiết bị phù hợp, thời gian thực hiện hàng giờ và một cơ sở phòng thí nghiệm trung tâm.

Do vậy một nhóm nghiên cứu do các nhà khoa học tại các phòng thí nghiệm của Jennifer Doudna – người được trao giải Nobel Hóa học năm 2020, David Savage và Patrick Hsu tại trường đại học California, Berkeley, đã hướng tới việc phát triển một xét nghiệm chẩn đoán nhanh hơn và dễ thực hiện hơn so với qRT-PCR. Đó là việc kết hợp hai dạng khác nhau của enzyme CRISPR để tạo ra một xét nghiệm có thể dò một lượng rất nhỏ RNA của virus trong thời gian dưới một giờ. Doudna giành giải Nobel hóa học 2020 Nobel cho phát minh về kỹ thuật chỉnh sửa hệ gene CRISPR-Cas9.

Trong khi kỹ thuật mới chưa vào đến giai đoạn để trở thành đối thủ xứng tầm về độ nhạy với qRT-PCR, vốn có thể dò được một vài bản sao chép của virus trên mỗi micro lít trong chất lỏng thì nó cũng sẵn sàng  khả năng chọn được RNA của virus theo từng mức – khoảng 30 bản sao chép trên mỗi micro lít – thích hợp để sử dụng để giám sát dân cư và giới hạn sự lan truyền mở rộng.

“Anh không cần phải đạt đến độ nhạy của PCR để về cơ bản bắt và chẩn đoán COVID-19 trong cộng đồng, nếu xét nghiệm đủ thuận tiện và đủ nhanh”, đồng tác giả David Savage, giáo sư sinh học phân tử và tế bào, nói. “Hy vọng của chúng tôi là thúc đẩy quá trình sinh hóa đến mức có thể hình dung ra một định dạng thuận tiện trong một môi trường mà bạn có thể được kiểm tra hàng ngày, chẳng hạn như ở cổng cơ quan”.

Các nhà nghiên cứu công bố kết quả thu được của mình trên tạp chí Nature Chemical Biology 1.

Phần lớn thử nghiệm dựa trên CRISPR đều được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và thực phẩm Mỹ chấp thuận cho việc sử dụng khẩn cấp nhưng tất cả các yêu cầu về bước đầu tiên, trong đó RNA virus được khuếch đại vì vậy dò được tín hiệu – vốn bao gồm việc giải phóng một phân tử huỳnh quang phát sáng dưới ánh sáng xanh – đủ sáng để nhìn thấy. Trong khi sự khuếch đại ban đầu này làm tăng độ nhạy của xét nghiệm ở mức tương đương như qRT-PCR, nó cũng tạo ra các bước khiến việc thực hiện xét nghiệm bên ngoài phòng thí nghiệm trở nên khó khăn hơn.

Nhóm nghiên cứu do các nhà khoa học ở UC Berkeley dẫn dắt cố gắng đạt đến một độ nhạy có thể chấp nhận được và tốc độ cần thiết mà không làm mất đi sự thuận tiện của xét nghiệm.

"Đối với các ứng dụng chăm sóc sức khỏe, anh cần phải có phản hồi nhanh để người sử dụng có thể nhanh chóng biết liệu họ có bị nhiễm hay không, ví dụ trước khi anh lên một chuyến bay hoặc đi đến một số nơi",  Tina Liu, một nhà nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Doudna ở Viện nghiên cứu hệ gene đổi mới sáng tạo (IGI), một trung tâm tập trung vào kỹ thuật CRISPR bao gồm các nhà khoa học ở UC Berkeley và UC San Francisco.

Bên cạnh việc khỏi có thêm bước tiếp theo, một nhược điểm khác của sự khuếch đại ban đầu là do nó tạo ra hàng tỉ bản sao RNA của virus nên tạo ra khả năng lây nhiễm chéo qua các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật mới do nhóm phát triển đã loại bỏ điều này. Thay vào đó, nó thúc đẩy tín hiệu huỳnh quang, loại bỏ nguồn lây nhiễm chéo chính.

Kỹ thuật phi khuếch đại này được họ đặt trên là Dò nuclease tích hợp nhanh trong nối tầng (FIND-IT), có thể tăng cường các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, giá thành rẻ cho nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác.

"Trong khi chúng tôi bắt tay vào dự án này, tôi nghĩ rằng kỹ thuật này có thể được ứng dụng cho nhiều dịch bệnh khác bởi vì cuối cùng thì CRISPR được lập trình sẵn”, Liu nói. “Vì vậy anh có thể tải enzyme CRISPR với một trình tự đích virus cúm hay bất kỳ loại virus RNA nào. Hệ thống này có tiềm năng hoạt động trên nhiều loại với cùng cách thức. Công trình này của chúng tôi thực sự khẳng định chính sinh hóa là cách làm đơn giản hơn để dò RNA và có năng lực dò RNA theo một khung thời gian nhanh hơn, nhạy hơn và có thể cho những ứng dụng tương lai để chẩn đoán sức khỏe”. 

Các nhà nghiên cứu hiện đang trong quá trình xây dựng khung để chẩn đoán bệnh bằng FIND-IT, bao gồm những bước tiếp theo để thu thập và xử lý các mẫu trong một thiết bị vi lưu.

Sử dụng các protein Cas nối tầng

Để loại việc khuếch đại đích, nhóm nghiên cứu đã sử dụng một enzyme CRISP - Cas13 – để dò RNA của virus đầu tiên và một dạng khác của protein Cas gọi là Csm6 để khuếch đại tín hiệu huỳnh quang.

Cas13 là mục tiêu chung hướng tới của các kéo cắt RNA; một khi nó liên kết với chuỗi đích của nó, được một RNA chỉ dẫn, nó được dùng để cắt trên một diện rộng các phân tử RNA khác. Hoạt động cắt do mục tiêu kích hoạt này có thể được sử dụng để phát hiện một vài chuỗi RNA cụ thể để giải phóng phân tử phóng xạ huỳnh quang. Tuy nhiên, có thể cần hàng giờ để Cas13 tạo ra một tín hiệu có thể dò được khi một lượng RNA rất nhỏ hiện diện.

Quan điểm của Liu là sử dụng Csm6 để khuếch đại hiệu ứng của Cas13. Csm6 là một enzyme CRISPR nhạy với sự hiện diện của một số vòng RNA nhỏ và được kích hoạt để cắt một phạm vi rộng các phân tử RNA trong các tế bào.

Để thúc đẩy việc dò Cas13, bà và cộng sự đã thiết kế một phân tử hoạt hóa có khả năng cắt khi Cas13 dò được RNA của virus. Một mảnh của chính phân tử này có thể kết nối và kích hoạt Csm6 để cắt và giải phóng một phân tử phát xạ huỳnh quang sáng từ một mảnh RNA. Thông thường, phân tử hoạt hóa này nhanh chóng bị Csm6 phá vỡ cho đến khi việc giới hạn lượng tín hiệu huỳnh quang được tạo ra. Liu và đồng nghiệp tạo ra một cách biến đổi về mặt hóa học chất hoạt hóa này để bảo vệ nó khỏi sự phân rã và có thể tăng nạp Csm6 nhằm lặp lại việc cắt và giải phóng các phân tử phát xạ huỳnh quang liên kết với RNA. Các kết quả này có độ nhạy gấp 100 lần chất hoạt hóa nguyên bản.

"Khi Cas13 được tăng thêm độ hoạt hóa, nó phân tách chất hoạt hóa đó, loại bỏ một segment bảo vệ chất hoạt hóa”, Liu nói. “Giờ nó được giải phóng, có thể hoạt động nhiều hơn với các phân tử khác của enzyme thứ hai là Csm6. Và do đó, một đích được Cas13 ghi nhận không chỉ bằng việc dẫn đến sự hoạt hóa của chính năng lực cắt RNA của nó; nó còn dẫn đến việc tạo ra nhiều enzyme hoạt hóa có thể cắt được nhiều phân tử phát xạ huỳnh quang hơn”. 

Nhóm nghiên cứu cũng kết hợp với một sự kết hợp tối ưu các RN hướng dẫn làm tăng cường việc ghi nhận độ nhạy của RNA virus nhiều hơn bằng c=kỹ thuật Cas13. Khi nó kết hợp với Csm6 và các chất hoạt hóa của nó, họ có khả năng dò được 31 bản sao mỗi micro lít của SARS-CoV-2 RNA trong ít nhất 20 phút.

Các nhà nghiên cứu cũng cho thêm RNA được lấy từ các mẫu bệnh phẩm vào xét nghiệm FIND-IT trong một ống vi lưu để xem xem liệu xét nghiệm này có thể đáp ứng với một thiết bị cầm tay không. Sử dụng một thiết bị nhỏ cùng một máy quay, họ có thể dò RNA của SARS-CoV-2 được lấy từ các mẫu bệnh phẩm với độ nhạy có thể phát hiện các lây nhiễm COVID-19 tại đỉnh điểm của chúng.

“Cách tiếp cận hạt nhân nối tầng này - Cas13 bổ sung Csm6— kết hợp tất cả mọi thứ vào một phản ứng tại một mức nhiệt độ 37 độ C, không đòi hỏi việc gia nhiệt lên mức cao hoặc các bước phức tạp như với những phương pháp chẩn đoán khác”, Liu nói. “Tôi nghĩ nó mở ra nhiều cơ hội  cho những xét nghiệm nhnh hơn, đơn gỉn hơn và có thể chạm đến một độ nhạy có thể so sánh được với những kỹ thuật hiện hành khác và có thể đạt tới độ nhạy cao hơn trong tương lai”.

Sự phát triển của phương pháp phi khuếch đại để dò RNA này là kết quả của một nghiên cứu tái định hướng trong IGI khi đại dịch bắt đầu gây ra những vấn đề khi chẩn đoán và điều trị COVID-19. Cuối cùng, năm phòng thí nghiệm tại UC Berkeley và hai phòng thí nghiệm tại UCSF đã tham gia vào dự án này, một trong số nhiều dự án thực hiện tại IGI.

“Khi chúng tôi bắt đầu điều này, chúng tôi hi vọng việc tạo ra những gì có thể chạm tới việc tương đương độ nhạy PCR, nhưng không đòi hỏi sự khuếch đại”, Savage, nhà nghiên cứu chính của dự án này nói. “Do đó, chúng tôi đã phải đổi mặt với một khoảng cách rộng mất mười nghìn lần để vượt qua. Chúng tôi đã phải đối mặt với khoảng cách lớn đó; chúng tôi tìm cách giảm chúng xuống ba bậc nữa. Nhờ vậy chúng toi đã ở đây. Vào cuối tháng 4 vừa qua, khi chúng tôi thực sự bắt tay vào định hình công việc, chúng tôi nhận thấy là dường như hầu hết đều không thể thực hiện được”. 

Thanh Phương tổng hợp

Nguồn: https://phys.org/news/2021-08-crispr-enzymes-covid-diagnostic-minutes.html
https://www.genengnews.com/news/crispr-enzyme-duo-enables-20-minute-covid-19-test/